Грицан А.А., Рудычева О.А.
Грицан Андрей Александрович, ведущий ветеринарный врач-консультант, Департамент развития и экспертизы, Дивизион птицеводства
Рудычева Ольга Андреевна, ведущий ветеринарный врач-консультант Департамента птицеводства
Группа компаний ВИК
Настоящая статья представляет собой обобщение опыта, накопленного специалистами лаборатории Эпсилон Био и ветеринарными врачами-консультантами группы компаний ВИК в ходе проведения тренингов и оказании методической поддержки сотрудникам производственных лабораторий сельскохозяйственных предприятий и диагностических центров крупных агрохолдингов. Полученный опыт был систематизирован и представлен в виде наиболее часто возникающих погрешностей, привязанных к схеме процесса постановки ИФА. Приведенный перечень ошибок не является полным, а только отражает наиболее встречающиеся. Данная статья будет полезна как начинающим операторам, чтобы осваивать метод ИФА, так и практикующим ветеринарным врачам. Материал может служить инструментом внутренней оценки правильности постановки ИФА и выявления возможных причин отклонений при получении результатов.
Введение. На сегодняшний день у ветеринарных врачей иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) является востребованным, простым и недорогим инструментом для оперативного контроля за эпизоотической ситуацией на предприятиях. Многообразие диагностических тест-систем и широкий перечень выполняемых исследований предполагает наличие глубокой теоретической подготовки в области постановки ИФА и практических навыков для ее исполнения. Несмотря на заявляемую производителями простоту и универсальность в постановке реакции, существует риск совершения оператором ошибок, которые ставят под сомнения результаты диагностики.
Использование внутреннего лабораторного контроля на всех этапах постановки и интерпретации полученных результатов позволяет вовремя заметить несоответствие и минимизировать потери, обусловленные лабораторными погрешностями.
В компании BioChek в тест-системе ELISA особое внимание направлено на внутренний контроль качества выпускаемых наборов и обеспечение готовых наборов всеми необходимыми инструментами.
Трехуровневый контроль помогает минимизировать потери, но не исключает риска ошибок, которые могут быть допущены оператором.
В данной статье предпринята попытка систематизировать часто встречающиеся ошибки, которые допускают операторы при постановке ИФА, независимо от используемых тест-систем.
Исходя из процесса проведения постановки ИФА, выделяют ошибки, которые возникают на различных этапах постановки реакции и интерпретации результатов.
В «долабораторный» или преаналитический этап работы входят ошибки, которые допускаются при работе с образцами до момента поступления их оператору. Сюда входят ошибки на этапе выбора объекта исследования (вид, возраст, клиническое состояние, срок с момента вакцинации и т.д.); техники получения образца (условия, при которых происходит отбор, инструмент, подготовка места отбора); хранения и доставки образца в лабораторию. На этом этапе среди ошибок наиболее распространенной является получение сыворотки крови с признаками гемолиза. Подробнее этап и его ошибки будут рассмотрены ниже.
Следующий аналитический этап – работа с пробой в лаборатории: подготовка к исследованию, разведению, если это необходимо, подготовка реактивов и постановка самой реакции. Наборы содержат 96-луночные планшеты с иммобилизированными антигенами. Данный этап продолжается до снятия показателей на приборе.
Приборный этап – снятие показаний с планшета на приборе, который может включать все процедуры, которые происходят при проведении автоматических видов анализа. Например, если мы ставим реакцию при помощи ручных дозаторов, то этот этап начинается в момент считывания оптической плотности с планшета, а если это автоматизированная система – то в момент постановки проб в прибор.
Постаналитический этап является завершающим, ошибки на данном этапе могут возникать при нарушении оформления результатов, интерпретации и выдачи заключений, а также некорректной трактовке полученных данных.
Рассмотрим подробнее типичные ошибки, возникающие на различных этапах постановки ИФА.
1) Преаналитический этап. Ошибки на этапе планирования отбора проб крови обесценивают все последующие этапы исследования.
В птицеводстве отбор проб осуществляется с целью получения достоверной информации о статусе контролируемой популяции, что достигается посредством статистической обработки результатов, полученных на основании исследования отдельных особей. Поэтому важно отобрать пробы, которые максимально отражают состояние всей популяции. Как правило, рекомендуется отбирать не менее 25 проб сыворотки крови от однородного по возрасту и физиологическому состоянию поголовья, содержащегося в птичнике. Однако при постановке реакции на 96-луночном планшете с учетом контролей обычно в реакцию берут по 18 проб с одного объекта, и эта выборка в результате анализа не всегда правильно отражает этиологию заболевания.
Важно при планировании отбора проб сыворотки четко определять цель исследования. Например, отбор в суточном возрасте проводится для понимания «материнского иммунитета» цыплят, прогнозирования проведения последующей вакцинации и статуса благополучия по исследуемым инфекциям. Известно, что источником антител класса IgG (Y) у цыпленка является желток, и более достоверные данные по уровню материнского иммунитета можно получить после полного рассасывания желточного мешка. Этот срок зависит от многих факторов и обычно составляет 3 дня. Поэтому для расчета считается более корректным брать сыворотку крови в 3-суточном возрасте. Однако на процесс окончательной стабилизации уровня сывороточных антител влияет много факторов (например, повышенная температура в птичнике способна ускорить рассасывание желтка, и др.). Окончательное решение по отбору проб остается на усмотрение ветеринарного врача.
Известно, что существуют суточные колебания показателей сыворотки крови у цыплят. Поэтому при оценке данных в динамике важно максимально выдержать близкие условия, влияющие на показатели. Время отбора проб – важный фактор, тем более что в производстве на него еще накладываются технологические приемы (кормление, интенсивность освещения, температура в птичнике). Для минимизации влияний этих факторов пробы стараются отобрать в утренние часы, когда птица имела доступ к воде, но не успела поесть. Не стоит отбирать пробы от птицы, которая была ограничена в доступе к воде. Кровь у такой птицы очень густая и быстро сворачивается, образуя в просвете иглы тромб. Если есть необходимость отобрать кровь у такой птицы, то ее можно напоить чистой водой через зонд и спустя некоторое время провести пункцию вен.
Отбор проб в птичнике должен производиться случайным образом. Не стоит специально отбирать кровь от больной птицы, если это не предусмотрено протоколом исследования. В терминальной стадии некоторых болезней при тяжелом поражении иммунной системы с глубокими нарушениями гуморального иммунного ответа результаты могут быть отрицательными. Для обеспечения случайности выборки рекомендуется использовать метод конверта.
При необходимости оценки динамики титра антител во времени проводят исследование парных сывороток: после первого отбора проб птицу отсаживают в изолятор, чтобы при повторном отборе в выборку попали те же особи.
На этапе отбора сыворотки крови в пробирки очень часто пренебрегают соблюдением температурного режима пробирок и предварительным смачиванием их стенок физиологическим раствором. Не всегда капли крови пускают по стенке для исключения удара. Игнорирование этих требований приводит к избыточному разрушению форменных элементов крови и гемолизу. Сыворотка со следами гемолиза не пригодна для серологических исследований, т.к. полученные результаты занижены и не отражают реальной картины.
Не менее важным фактором, влияющим на достоверность анализа в ИФА, является соблюдение условий хранения диагностических наборов. Нарушение режимов хранения наборов, резкие температурные колебания приводят к снижению активности и специфичности антигенов, антител и конъюгатов, входящих в состав наборов. Случайное замерзание конъюгата при транспортировке или при хранении набора приводит к резкому ослаблению его ферментативной активности и падению сигнала. В результате наблюдаются низкие значения оптической плотности для положительных контролей (низкая чувствительность) и высокие значения оптической плотности для отрицательных контролей (низкая специфичность). Воздействие влаги на иммуносорбент после вскрытия упаковки также приводит к снижению активности и специфичности. Важно не вскрывать упаковку до постановки реакции, пока планшет не прогреется до комнатной температуры, т.к. конденсат может выпасть на дно лунок.
2) Аналитический этап. К контролируемым параметрам аналитического лабораторного этапа относятся микроклимат лаборатории, подготовка проб сыворотки и дозирование реагентов, а также процессы, связанные с проведением реакции (перемешивание, термостатирование, продолжительность инкубации и т.д.), подготовка шаблона и регистрации проб в программах.
Микроклимат в комнате для постановки реакции играет особое значение. Повышенная температура в помещении ускоряет ферментативную реакцию, и полученные значения отрицательного контроля могут быть очень высокими, делая невозможной корректную интерпретацию. Программа в данном случае автоматически бракует полученные данные при считывании планшета. Напротив, пониженная температура в помещении негативно отразится на значениях положительного контроля, снижая чувствительность метода. Обязательно контролировать температуру рабочей поверхности, на которой ставится реакция, запрещено использовать металлические столы. Также использование локальных обогревателей в холодное время года не создает нужную постоянную температуру в рабочей зоне, для обогрева кабинета используйте сплит-системы или радиаторное отопление, контролируйте температуру рабочей зоны термометром.
Недостаточность вентиляции не влияет напрямую на ход реакции. Однако этот фактор оказывает существенное влияние на внимательность и работоспособность оператора и увеличивает риск ошибки при внесении реагентов. Обязательное использование респиратора при постановке реакции усугубляет влияние этого фактора.
Достаточная рабочая площадь стола для постановки реакции и размещения дозирующего оборудования снижает вероятность розлива реагентов, опрокидывания ванночек, внесения реагентов не в те лунки планшета, позволяет выстроить ритмичность и поточность процесса. Автоматическое промывающее устройство лучше разместить на отдельном столе. Сюда же стоит разместить канистры для реагентов и отходов. Размещение канистры для отхода вне видимости оператора часто приводит к розливу отходов, что в условиях работы с ПБА считается аварией и требует проведения ряда мероприятий не только по механической очистке, но и дезинфекции помещений и оборудования. Прибор для считывания результатов очень часто располагают на столе для работы с документами, т.к. он связан с персональным компьютером.
В производственных лабораториях аналитический этап начинается в момент поступления проб крови в лабораторию. Важно, чтобы после отбора проб сформировался устойчивый сгусток крови. Достигается это сохранением температурного режима сразу после отбора, во время доставки проб и помещением штатива с кровью в термостат на 20 мин при температуре 36–37°С. Хорошо сформированный сгусток легко отделяется от стенок пробирки тонкой спицей из нержавеющей стали или тонкой стеклянной пипеткой Пастера. На этом этапе важно не допустить выхода форменных элементов крови в результате разрушения сформировавшегося сгустка, а также контаминации образцов. К забору сыворотки крови из пробирки со сгустком приступают как можно раньше после ее самопроизвольного отделения или после центрифугирования.
Отсутствие надписей на пробирках увеличивает риск путаницы, особенно в условиях многозадачности. Важно, чтобы проба была прослеживаема на всех этапах от отбора до утилизации.
Сыворотка крови богата питательными веществами и ферментами. Длительная ее выдержка при комнатной температуре может привести к порче. Поэтому необходимо как можно быстрее охладить сыворотку и в случае необходимости заморозить.
Для постановки реакции чаще всего используют замороженные пробы сыворотки крови. При перепадах температуры на поверхности холодных пробирок образуется конденсат, поэтому не следует размораживать пробирки открытыми. Это исключит разбавление сыворотки конденсатом, что критично для небольших объемов.
Хранение сыворотки в открытых пробирках при комнатной температуре в условиях низкой влажности способствует испарению жидкости, что концентрирует пробу. Это особенно важно при небольших объемах проб.
Размораживание сыворотки проводится при комнатной температуре. Важно, чтобы все реагенты, расходные материалы и оборудование, участвующие в реакции, были одинаковой комнатной температуры.
Частым источником ошибок является неполное перемешивание сыворотки после ее размораживания. Для разрушения градиента концентрации сывороточных компонентов, образующегося при размораживании, необходимо тщательно перемешать сыворотку путем ручного взбалтывания либо на вихревом или ротационном смесителе.
Плотность сыворотки отличается от плотности буферных разбавителей, поэтому приготовленные разведенные пробы необходимо тщательно перемешать перед проведением анализа или для приготовления последующих разведений. Перемешивание проб должно проводиться аккуратно, без избыточного вспенивания, т.к. это может привести к разрушению лабильных аналитов. Если разведение проб проводится в лунках микропланшета, то его нельзя использовать повторно. Для этих целей также исключается использование планшетов с сорбированными антителами или антигенами, бывшими в употреблении.
Перед проведением исследования необходимо провести визуальный осмотр пробы сыворотки на наличие включений. Использование образцов сывороток, содержащих сгустки фибрина, осадок или взвешенные частицы может привести к ошибке из-за сложностей в точном отборе дозатором. В таких случаях необходимо провести центрифугирование, чтобы включения осели на дно, и отобрать супернатант для исследования.
Недопустимо использовать образцы сыворотки с признаками микробиологической порчи. Такими признаками являются комковатый осадок, мутность, неприятный запах, плесневые вкрапления. В таких пробах прошли серьезные биохимические изменения, которые влияют на реакцию антиген-антитело.
Незапланированный перенос анализируемого материала из одной пробы в другую исключается при использовании отдельных одноразовых наконечников. Не стоит в целях экономии мыть одноразовые наконечники и использовать их повторно. При использовании одноканального дозатора следует использовать новый наконечник для каждого образца, а при использовании многоканального дозатора – новые наконечники для каждого реагента.
Инкубирование планшета с внесенными реагентами (сывороткой) должно проводится при строгом соблюдении температуры и времени. Температура влияет на скорость протекания реакции. Известно, что высокая температура ускоряет реакцию, и это проявляется в виде повышения оптической плотности положительных контролей. Попытки сократить время инкубации при высоких температурах не дают прогнозируемых значений положительного контроля. Поэтому в жаркое время года необходимо предпринять меры по стабилизации температуры в рабочей зоне. Хорошим решением является использование для инкубации в лаборатории термостата с возможностью поддержания необходимого диапазона температур и оборудование кабинета кондиционером.
Особое внимание необходимо уделять дозирующим устройствам. Следует с регулярной периодичностью, определенной производителем дозаторов, проводить их техническое обслуживание и калибровку. Методика калибровки отражена в паспорте. Обычно рекомендуется не реже одного раза в месяц (лучше еженедельно) проводить проверку работы дозаторов на точность и сходимость результатов пипетирования, например, весовым методом. Допустимая погрешность пипеток не должна превышать 5%.
Правильная и аккуратная работа с дозатором снижает вероятность ошибки. Проверка герметичности крепления наконечников, визуальный контроль набора дозируемой жидкости, опора на локоть, стоящий на столе, фиксация планшета другой рукой и порядок внесения (обратное или прямое дозирование) – все это повышает качество постановки реакции.
Невнимательность при внесении сыворотки и реагентов в плашки может привести к появлению случайных ошибок. При обнаружении таких ошибок испорченные лунки нельзя опорожнять и использовать заново. Их следует забраковать и провести анализ повторно. Следует в самом начале заклеить ряды лунок на планшете, которые не будут принимать участие в постановке. Это позволит исключить случайное попадание в эти лунки реагентов и сохранить их до следующего раза. После удаления жидких реагентов и высушивания такие планшеты хранят в оригинальной упаковке с осушителем воздуха при температуре от +2 до +8°С в течение всего срока годности набора.
Необходимая точность внесения реагентов достигается не только использованием стандартизованных и поверенных дозаторов, но и достаточным практическим опытом оператора. Точность и воспроизводимость результатов не должны зависеть от того, кто из операторов выполняет постановку ИФА. Лучшим решением будет закрепление одного оператора с внедрением элементов внутрилабораторного контроля. Использование контрольных сывороток при постановке реакции позволит выявить критичные отклонения в результатах, но незначительно увеличит затраты на наборы. Не следует многократно замораживать контрольную сыворотку. Лучше сразу во время приготовления разлить ее в несколько пробирок и далее доставать в работу одну из партии. Лучшим решением в таком случае будет использование референс-контроля с известным значением содержания антител к искомому заболеванию.
Использование для разведения реактивов воды, не соответствующей требованиям, вносит существенный вклад в снижение качества постановки реакции. Обычно для приготовления растворов используют дистиллированную или деионизированную воду. Сезонные колебания качества водопроводной воды (весна, осень) могут оказывать существенное влияние на качество дистиллированной воды и, как следствие, на ход реакции. Длительное хранение воды в канистрах может привести к микробной контаминации и появлению хлопьев, которые влияют на работу промывающего устройства. Для приготовления реактивов и промывки оборудования рекомендуется использовать свежую дистиллированную (деионизированную) воду не старше 2–3 дней. Каждую партию дистиллированной воды необходимо предварительно проверить на качество. Не следует хранить дистиллированную воду в металлических емкостях или добавлять консерванты для ее длительного хранения. Обязательным является проверка показателей рН воды и ее электропроводности для каждой новой партии.
При использовании автоматического промывающего устройства очень часто операторы ставят на промывку планшет и дальше продолжают заниматься другими операциями. Неравномерное заполнение лунок моющим буфером и/или его неполное удаление вследствие засорения одного из его каналов кристаллами солей буферного раствора или другими крупными взвешенными частицами и возникающая при этом недостаточная промывка, т.е. неполное удаление непрореагировавших компонентов (особенно конъюгата), приводят к увеличению сигнала в определенном ряду лунок (или в одной и той же лунке при использовании 96-канального промывателя) на разных планшетах. Поэтому необходимо каждый раз визуально контролировать качество (однородность) заполнения лунок и удаления растворов. Заполнение лунок во время промывки способствует полному удалению следов сыворотки и коньюгата с их внутренних боковых поверхностей.
Необходимо следить за временем и кратностью пребывания моющего буфера в лунках. Увеличение количества циклов мойки может приводить к падению сигнала и недостоверности полученных результатов.
Согласно инструкции производителя, моющий буфер после разведения можно хранить в течение месяца при температуре +4°С. Для промывки планшетов используем моющий буфер комнатной температуры. Внесение в лунки холодных реагентов с большой долей вероятности приведет к получению некорректных результатов из-за нарушения процесса установления равновесия в диагностической системе.
Большое значение при постановке реакции имеет ритмичность внесения реагентов. Не должно быть больших перерывов во внесении реагентов. Влияние этого фактора хорошо видно при внесении контрольных (калибровочных) проб, когда анализируемые образцы еще не готовы или вносятся партиями через определенный промежуток времени. В данном случае процесс инкубации для разных проб должен быть различным. Несоблюдение этого условия приведет к изменению параметров связывания и искажению результатов. Рекомендуемое время заполнения планшета каждым из последующих реагентов должно быть примерно одинаковым и составлять не более 2 мин.
Нельзя оставлять не заполненными реагентами лунки в перерывах между различными стадиями анализа. Даже незначительное их высушивание, которое, к тому же, происходит в таких условиях неравномерно, может привести к неконтролируемому снижению сигнала. При вынужденных перерывах в работе можно на некоторое время положить планшет вверх дном на смоченный водой лист фильтровальной бумаги.
Стадия внесения и инкубации с раствором субстрата требует внимательного отношения к температуре, временным интервалам и минимальному пребыванию реагента на свету. Сокращение количества ложноположительных результатов через уменьшение периода инкубации не только не позволяет выявить истинную причину их появления, но и приводит к росту числа ложноотрицательных проб. Длительное пребывание субстрата на свету приводит к его произвольному окрашиванию (аутоокислению), а инкубация планшета в присутствии света может привести к появлению краевых эффектов.
Внесение стоп-реагента приостанавливает ход реакции с субстратом. Для протекания реакции во всей лунке необходимо перемешать планшет. Это можно сделать на шейкере или легким постукиванием по ребру планшета. Так как реакция окисления хромогена после внесения кислоты до конца не останавливается, и оптическая плотность растворов в лунках продолжает возрастать, необходимо как можно раньше снять показания оптической плотности лунок на приборе. Снятие показаний по истечении 30 мин после внесения стоп-раствора может оказывать существенное влияние на результат.
Для сокращения времени с момента внесения стоп-реагента до считывания показаний на приборе необходимо заранее подготовить в программе шаблон для считывания.
3) Приборный этап. На точность измерения прибором оптической плотности существенное влияние оказывает предварительный прогрев прибора. При недостаточном прогреве возможно превышение допустимой погрешности. Качество работы спектрофотометра можно проверить путем повторного измерения оптической плотности. Полученные значения не должны иметь разницу более чем 2% в одних и тех же лунках. При этом необходимо помнить, что после добавления стоп-раствора необходимо снимать показания в течение первых 30 мин.
При проведении измерения важно правильно выбрать длину волны. Несоответствие длины волны на приборе при снятии показаний и заявленной длины волны в паспорте к набору может привести к заниженным значениям оптической плотности лунок и, как следствие, к недостоверным результатам.
Перед считыванием важно обратить внимание на визуальную окраску положительных и отрицательных контролей. Отсутствие окраски положительных контролей указывает на ошибки при постановке. Такими причинами могут быть невнесение реагентов (конъюгат или субстрат) в лунку контролей, недостаточное время инкубации, низкая температура, нарушение условий хранения набора или истечение срока его годности.
Любые загрязнения на планшете могут привести к искажению результатов измерения оптической плотности. Отпечатки пальцев, надписи маркером и капли можно аккуратно протереть мягкой сухой безворсовой салфеткой. Пузырьки воздуха из лунок можно удалить запаянным наконечником. Царапины, сколы и другие видимые изменения убрать не получится, поэтому необходимо как можно аккуратнее обращаться с планшетами при манипуляциях (промывка, выстукивание).
Для проверки работы спектрофотометра можно дополнительно приобрести поверочный (верификационный) планшет.
4) Постаналитический этап. На этом этапе ошибки допускаются при переносе полученных значений в рабочие журналы и отчеты. Ошибки, полученные на этапе оформления отчетов, ставят под сомнение правильность постановки реакции и недоверие к полученным результатам со стороны заказчика. Важно не только с соблюдением всех требований провести постановку реакции, но и корректно оформить и предоставить заказчику полученные результаты.
Использование возможностей программы BioChek 11 позволяет избежать ошибок на этапе оформления и интерпретации полученных результатов. Формирование информативных отчетов позволяет облегчить интерпретацию результатов, получить всю необходимую информацию для оценки эффективности проводимых мероприятий, выбора схем вакцинации, аналитических отчетов по средним титрам стада в динамике (рис. 2 и 3) и формирования прогнозов дат вакцинации (рис. 4).
Заключение. Планомерная работа по выявлению лабораторных ошибок при постановке ИФА достигается выстроенным технологическим процессом отбора, доставки и хранения проб сыворотки крови (плазмы), постановки реакции с обязательным внутренним контролем. Своевременное внедрение элементов внутреннего и внешнего аудита процесса, участие в сравнительных испытаниях, ежегодное подтверждение квалификации оператора и всесторонний анализ результатов позволяют своевременно выявлять риски совершения ошибки и повысить достоверность и качество проводимых исследований.
Результатом долгосрочного и плодотворного сотрудничества ГК ВИК с компанией BioChek стало создание эффективной системы менеджмента качества, аккумулирующей лучшие практики лабораторной диагностики и многолетний ветеринарной опыт. Такой партнерский подход не только минимизирует риски лабораторных ошибок, но и формирует фундамент для постоянного совершенствования диагностических процессов, что, в конечном итоге, гарантирует надежность каждого полученного результата.