Бабин Г.Ю., Голубчикова О.А., Дорофеева С.Г.
Григорий Юрьевич Бабин, Ольга Андреевна Голубчикова, Светлана Глебовна Дорофеева
Группа компаний ВИК
Аннотация: Инфекционная бурсальная болезнь птиц (ИББ, болезнь Гамборо) представляет собой высоко-контагиозную вирусную инфекцию. Экономическая значимость этой болезни определяется значительным ущербом вследствие падежа и вынужденного убоя птицы, а также повышенного поражения организма вторичной патогенной микрофлорой и затрат на проведение ветеринарно- санитарных мероприятий. Во-вторых, что наиболее важно, ИББ вызывает сильнейшую продолжительную иммуносупрессию. ИББ среди птицепоголовья возникает внезапно, уровень заболеваемости достигает до 100%, а смертность – в среднем 20-30%. Ветеринарным врачам необходимо подтвердить клинические признаки болезни лабораторными исследованиями, и для этого используется метод иммуноферментного анализа (ИФА), который является наиболее чувствительным методом, превосходящим остальные. Универсальность метода позволяет в срав-нительно короткие сроки проводить массовые серологические исследования. На сегодняшний день лидером в области ИФА-диагностики болезней птиц является компания «BioChek»: ее тест-системы ИФА позволяют не только достоверно проводить мониторинг инфекций, но и оценивать уровень материнских антител с целью точного расчета дня входа с вакцинацией. В статье представлена информация по мониторингу и контролю ИББ на птицефабрике Центрального региона РФ с использованием тест-системы «BioChek» на основе ИФА. При анализе материала, полученного в ходе серологических исследований, учитывали коли-чество и продолжительность выявления материнских антител, которые зависят как от возраста птицы, в котором проводили вакцинацию родительских стад, так и от кратности, способа вакцинации и вида вакцины. В основу расчета даты вакцинации по ИББ положена формула Девентера. Исходный титр мате-ринских антител, период полураспада, целевой титр используемой вакцины и возраст птицы – необходимые данные для введения в формулу Девентера и получения прогнозируемой даты проведения вакцинации.
Ключевые слова: тест-система «BioChek», иммуноферментный анализ (ИФА), инфекционная бурсальная болезнь (ИББ), вирус, патогенность, диагностика, период полураспада, вакцина, профилактика, титры антител, формула Девентера.
Введение. Инфекционная бурсальная болезнь птиц (ИББ; тж. болезнь Гамборо, инфекционный бурсит кур), представляет собой высококонтагиозную вирусную инфекцию преимущественно цыплят. Основными клетками мишенями являются лимфоидные, особенно В-клетки, а из тканей наиболее тяжелому поражению подвергается лимфоидная ткань клоакальной сумки [1].
Вирус ИББ принадлежит к семейству РНКсодержащих вирусов Birnaviridae. Как известно, существует два его серотипа, но только серотип 1 является патогенным. Вирус обладает высокой устойчивостью к большинству дезинфицирующих средств и условиям окружающей среды [2].
В 1962 г. эту специфическую болезнь описал Cosgrove A.S. (США) и назвал ее «нефроз птиц», вследствие значительного поражения почек у инфицированной птицы. В дальнейшем было доказано, что данное заболевание поражает, в первую очередь, фабрициеву сумку, а нефроз является осложненным признаком; поэтому болезнь переименовали в инфекционный бурсит. Название «болезнь Гамборо» ассоциируется с местностью, где это заболевание регистрировалось впервые.
Экономическая значимость ИББ проявляется в двух направлениях. Во-первых, она касается клинического течения болезни и смертности цыплят 3-недельного возраста и старше. Во-вторых, что наиболее важно, болезнь у инфицированной в раннем возрасте птицы проявляется продолжительной иммуносупрессией [1].
Болезнь причиняет огромный экономический ущерб, складывающийся из большого падежа молодняка птицы (до 40%) и вынужденного убоя, а также из-за проявления вторичных респираторных и других бактериальных инфекций на фоне ИББ [3].
В настоящее время известно, что куры являются единственными представителями животного мира, у которых при воздействии вируса ИББ развивается клиническая форма болезни с характерными патологоанатомическими изменениями органов. Необходимо отметить, что в отношении кур полевые вирусы проявляют различную степень патогенности. Вакцины для кур против ИББ имеют различную инвазивность.
Болезнь возникает внезапно и быстро распространяется среди птицепоголовья. Уровень заболеваемости достигает обычно до 100%. Смертность может быть как нулевой, так и выше 20-30%. Падеж начинается обычно на 3 день после инфицирования, достигает пика и потом начинает снижаться через 78 дней [1]. Проявляется ИББ в двух формах: клиническая и субклиническая.
Первые симптомы клинической формы: диарея, сопровождающаяся выделением водянистого беловато желтого помета; внезапная потеря аппетита; тремор ног, головы и внезапная гибель. Заболеваемость и смертность нарастают быстро и достигают максимума на 34 день болезни. При снижении вирулентности вируса смертность в стаде снижается.
Патологоанатомические признаки при клинической форме болезни: в начальной стадии заболевания отмечается воспаление фабрициевой сумки: ее увеличение, отек, гиперемия и кровоизлияния. При гистологическом исследовании наблюдают гибель лимфоидных элементов, некробиоз лимфоцитов. Обнаруживаются кровоизлияния в различных группах мышц (обычно грудных и бедренных), на слизистой железистого желудка и в слепокишечных миндалинах. Почки увеличены, от светло серого до темно коричневого цвета, с четким рисунком заполнения уратами канальцев и мочеточников [4]. При острой клинической форме заболевания бурса заполняется запекшимся фибрином. У переболевшей птицы бурса постепенно атрофируется.
Субклиническая форма наблюдается у цыплят в возрасте менее 4 недель, когда иммунная система наиболее чувствительна к повреждениям. Материнские антитела помогают предотвратить развитие клинической формы, но не вирусной репликации в бурсе. Характерна атрофия бурсы, иммуносупрессия вследствие снижения количества В-лимфоцитов. Повышается восприимчивость к вторичным бактериальным и вирусным инфекциям. Наблюдается увеличение среднесуточной смертности и конверсии корма.
Для подтверждения диагноза на ИББ необходимо провести дифференциальную диагностику; в первую очередь, необходимо исключить инфекционный бронхит, отравление сульфаниламидами, микотоксикозы, а также болезнь Ньюкасла, нефроз нефрит, лимфоидный лейкоз, болезнь Марека, жировые токсикозы.
В связи с серьезной потерей прибыли птицепредприятиями при вспышке ИББ особое значение имеет лабораторная диагностика. В настоящее время ветеринарные специалисты в большинстве случаев для подтверждения диагноза заболеваний и мониторинга циркуляции вирусов отправляют в лабораторию образцы крови для исследований методом иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА является наиболее чувствительным методом диагностики, значительно превосходящим другие иммунологические реакции. ИФА не требует сложного дорогостоящего оборудования и позволяет в сравнительно короткие сроки проводить массовый серологический мониторинг распространения возбудителей болезней среди птицепоголовья и контроля напряженности иммунитета в стаде. Принцип ИФА основан на визуализации иммунных комплексов за счет использования конъюгированных с ферментом антител. Фермент, как правило, пероксидаза хрена, взаимодействуя с хромогенным субстратом, может быть обнаружен даже в очень низких концентрациях. Хромогенный эффект с высокой степенью точности фиксируют средствами спектрофотометрии.
Все существующие отечественные и импортные коммерческие Тест-системы ИФА представляют собой твердофазный вариант, в котором специфический иммунносорбент иммобилизован на поверхности пластика. Принцип метода заключается в образовании комплекса антитело антиген при внесении вирусного антигена в лунки полистироловой планшеты с иммобилизированными антителами. После внесения исследуемой сыворотки, в которой присутствуют специфические антитела, блокируются свободные антигенные детерминанты образовавшегося иммунного комплекса, и антивирусный конъюгат не вступает в реакцию с антигеном [3].
Лидером и новатором в области ветеринарной лабораторной диагностики методом ИФА является компания BioChek, основанная в 1997 г. в Нидерландах. Тест-системы ИФА BioChek позволяют не только достоверно мониторить эпизоотический фон в бройлерных и родительских стадах, но и оценивать уровень материнских антител.
В статье представлены практические рекомендации по системному мониторингу и контролю циркуляции вируса ИББ на птицефабрике Центрального региона по трем цехам площадки БП-16 с использованием тест-системы компании BioChek. Согласно полученным гистограммам, проведена аналитика защитных титров материнских антител с определением точек входа проведения вакцинации.
Материал и методика исследований. Для специфической профилактики ИББ применяют вакцины, которые по антигенной активности можно разделить на 5 видов: 1. Мягкие – из аттенуированного вируса, не вызывающие существенных изменений в бурсе. Эффективны у цыплят, не имеющих материнских антител. Применяются такие вакцины и при снижении патогенности полевого вируса, когда болезнь протекает бессимптомно. Используют редко.
2. Вакцины промежуточного типа из вируса умеренной вирулентности. Эффективны в условиях острой вспышки инфекции и в стационарно неблагополучных хозяйствах, т.к. такие вакцины способны формировать иммунитет у цыплят с материнскими антителами и создавать нужную защиту в более ранние сроки.
3. Вакцины вирулентные из слабо аттенуированного вируса, вызывающего острые изменения в фабрициевой сумке. Это «горячие вакцины», которые вызывают клиническое переболевания птицы, но с меньшим отходом (до 2%). Они способны формировать иммунитет у цыплят, имеющих материнские антитела. Недостатком таких вакцин является их выраженная остаточная вирулентность, способность вакцинных вирусов персистировать во внешней среде и вызывать иммуносупрессивное действие.
4. Инактивированные вакцины – обеспечивают более напряженный иммунитет у цыплят, позволяют защитить молодняк птицы от заболевания ИББ в ранний период их жизни [4].
5. Иммунокомплексные вакцины поселяются в фолликулярных дендритных клетках (селезенка). Эти клетки способны связывать и сохранить иммунокомплексы, так что они уклоняются от иммунной системы. По мере снижения уровня материнских антител, вирус диссоциируется от антитела, и доходит в бурсу. Антитела связаны с вакцинным вирусом ковалентными связями. Вакцинный штамм реплицируется в каждом цыпленке, когда птица готова принять вирус. Иммунокомплекс безопасен в инкубаторе и in ovo [5].
Антитела, переданные от матери через желток яйца, могут защитить птенцов против раннего инфицирования вирусом ИББ. При этом также обеспечивается защита от иммуносупрессивного эффекта вируса. Полупериод существования материнских антител против вируса ИББ составляет от 3 до 5 дней. Следовательно, если известны титры антител потомства, можно предсказать время появления у цыплят чувствительности к вирусу. B. Lucio и S. B. Hitchner доказали, что после падения титров антител ниже 1:100 цыплята стали абсолютно чувствительными к инфекции. В то же время, титры от 1:100 до 1:600 дают приблизительно 40% защиты от заражения. J. K. Skeeles отмечал, что титры должны упасть ниже 1:64, прежде чем станет возможна эффективная вакцинация цыплят ослабленным штаммом вируса ИББ [1]. Такие титры также называют целевыми, их учитывают при входе с вакцинацией против ИББ. Из общемировой практики сотрудников компании BioChek эти титры имеют следующие значения: горячие вакцины – 800-1000, промежуточные вакцины – 500-800; мягкие вакцины – 250-500. Прогнозируя дату вакцинации, необходимо учитывать преодолеваемый уровень материнских антител различных вакцин (табл. 1).
Исключение составляет иммунокомплексные вакцины – Бурсаплекс производства Zoetis, или аналог, вакцина Трансмун производства Ceva, где титр материнских антител имеет меньшее значение, и вакцинация проводится в инкубатории. Применение иммунокомплексной вакцины Бурсаплекс позволяет исключить расчет первой даты вакцинации, которая зависит от титров материнских антител, и, тем самым, избежать погрешности в качестве вакцинации птицы. Данный эффект связан с принципиально иным механизмом действия иммунокомплексных вакцин.
Количественные показатели и продолжительность выявления материнских антител у цыплят зависят как от возраста, в котором проводили вакцинацию родительских стад, так и от кратности, способа вакцинации и вида вакцины.
Период полураспада антител – время, за которое уровень антител в результате их распада снижается в 2 раза. Продолжительность этого периода для каждого вида птиц более или менее постоянна, однако она может различаться в зависимости от кросса и возраста. Доказано, что период полураспада материнских антител к вирусу ИББ варьирует в зависимости от возраста (табл. 2) [3,5]. Во многом он зависит от условий содержания, кормления, и является величиной, отличительной для каждого стада.
Для установления оптимальных сроков иммунизации предложена математическая формула (формула Девентера), где, исходя из значений титра антител у суточных цыплят и периода их полураспада, рассчитывают сроки вакцинации против ИББ [3]:
ВВ= (log2 ИТ – log2 ЦТ) х ПП + В,
где ВВ – возраст вакцинации, ИТ – исходный титр материнских антител; ЦТ – целевой титр материнских антител; ПП – период полураспада; В – возраст птицы в момент взятия крови.
Отмечалось, что важным моментом является то, что значения периода полураспада зависят от возраста птицы на момент взятия пробы. Это важно, поскольку правильный прогноз даты вакцинации также зависит от правильного использования значений периода полураспада, которые должны соответствовать возрасту отбора сыворотки крови. Самый высокий период полураспада (4,6 дня) наблюдается в течение первых 2 дней жизни птицы; после этого, между 3 и 10 днями, он снижается до 4,0 дней с примерно постоянной скоростью [5].
Считается, что более высокие значения периода полураспада в течение первых 2 дней жизни цыпленка являются результатом повышения титров материнских антител из-за «эффекта желточного мешка». Резорбция желтка, содержащего материнские антитела, наиболее высока в течение первых 3 дней жизни цыпленка, что приводит к повышению (или стабилизации) титров.
Прогнозы даты вакцинации против ИББ, основанные на расчетных значениях периода полураспада, дали высокий уровень точности (около 97%), что дополнительно подтверждает рекомендации BioChek по значениям периода полураспада.
Кроме того, существует ряд обязательных условий, от выполнения которых зависит успех проводимой вакцинации. В частности, образцы крови следует отбирать от клинически здоровой птицы, не менее 23 проб сыворотки крови с корпуса/цеха, отбор осуществляется методом конверта (рис. 1). Прогнозы даты вакцинации на основании лабораторных исследований помогут ветеринарному специалисту применить живые вакцины в нужное время, чтобы обеспечить разумный «прием» вакцины, без нейтрализующего эффекта материнских антител.
Дополнительный мониторинг средних титров через 35 недель после живой вакцинации против ИББ также полезен для определения того, была ли вакцинация (и прогнозирование ее срока), в конечном итоге, успешной или нет. Если средние титры находятся в пределах ожидаемого диапазона после вакцинации, вакцинация и прогноз считаются успешными. Если результирующие титры антител ниже ожидаемых уровней и/или содержат высокий процент отрицательных результатов, это обычно указывает на слишком раннюю вакцинацию [5]. Результаты исследований их обсуждение. На рис. 2 показано, почему нельзя ориентироваться на уровень материнского иммунитета по 10 пробам сыворотки крови от птицы с одного цеха: при этом наблюдается высокий коэффициент вариации титров (CV, %) из-за разброса титрогрупп, и нельзя понять, какой процент поголовья имеет низкий титр антител и готов к вакцинации, и у какого процента птицы уровень материнских антител еще не скоро достигнет уровня целевого «пробивного» титра вакцины. В результате прогноз вакцинации недостоверен из-за малой выборки птицы.
На рис. 3 коэффициент вариации титров находится в ожидаемых пределах (диапазон 30-50%), средний титр соответствует половине антител, полученных от матери (исходя из схемы вакцинации родительского стада). Исследуемая сыворотка получена от бройлеров, комплектующихся из одного и того же родительского стада, разница возраста родителей – до 2 недель. В данном случае рекомендуется проводить мониторинг материнских антител у цыплят в возрасте от 3 до 5 дней от каждого комплектующего родительского стада.
На рис. 4 виден разнообразный уровень материнских антител, большой разброс титрогрупп и высокий коэффициент вариации. Данный бройлерных цех комплектовали от инкубационного яйца трех разновозрастных собственных родительских стад, и инкубационного яйца, поступившего из Турции. У цыплят с титрами от второй до четвертой титрогрупп, при отдельном расчете по формуле Девентера, уровень материнских антител уже к 10-11 дню жизни будет ниже целевого титра промежуточной живой вакцины. Цыплята с титрами от седьмой по девятую титрогруппу будут готовы к вакцинации примерно к 14-15 дню. Поэтому сложно рассчитать универсальную дату входа с вакцинацией для всего цеха. Для некоторых цыплят будет или слишком рано, или слишком поздно. В этом случае рекомендуется применить иммунокомплексную вакцину на инкубаторе с целью выравнивания уровня материнских антител перед праймированием живой вакциной. Также рекомендуем раз в тур отбирать сыворотку крови птицы из произвольных цехов за 12 дня до планируемой второй вакцинации с целью мониторинга распада материнских антител. Это позволит удостовериться, что уровень антител снизился у большего количества поголовья до целевого титра используемой вакцины. На основании полученных гистограмм ветеринарный врач производит расчет дня входа с вакцинацией.
Рассмотрим варианты таких расчетов по результатам исследований сыворотки крови бройлеров из цехов 54, 57, 62 площадки БП-16, т.е. на основе данных рис. 24 (табл. 35).
Цех 54 площадки БП-16 достигнет целевого титра – 500 антител – в следующие сроки: на 13 день жизни – 30% поголовья, на 14-16 дни жизни – 60% поголовья (табл. 3). Однако данный расчет является неинформативным из-за малой выборки.
Цех 57 площадки БП-16 достигнет целевого титра – 500 антител – в следующие сроки: 12 день жизни – 22,7% поголовья, 14 день жизни – 77,2% поголовья (табл. 4).
Цех 62 площадки БП-16 достигнет целевого титра – 500 антител – в следующие сроки: 12 день жизни – 39,1% поголовья, 14 день жизни – 73,9% поголовья (табл. 5).
В зависимости от желаемого % покрытия ветеринарный врач выбирает день входа с вакцинацией против ИББ. Прогноз возрастов вакцинаций, рассчитанный в программе BioChek по формуле Девентера, представлен в табл. 6.
По результатам отчета «Прогноз даты вакцинации» в программе BioChek:
птица цеха №54 площадки БП-16 достигнет целевого титра (500 антител) в возрасте 12 дней – 30% покрытие поголовья, в возрасте 16 дней – 70% покрытие поголовья;
птица цеха №57 площадки БП-16 достигнет того же целевого титра в возрасте 12 дней при 30%ном покрытии поголовья, в возрасте 14 дней – 70%-ном покрытии;
птица цеха №62 площадки БП-16 достигнет целевого титра в возрасте 12 дней с 30%ным покрытием поголовья, в возрасте 13 дней – 70%-ным.
При планировании проведения счете целевого титра материнских антител наблюдается расхождение во времени первой вакцинации, и по % стада с титром антител, говорящем о готовности к успешной вакцинации. В этот период важной информацией является история вакцинации, возраст, однородность стада и комплектация родительских стад. Характерно, что собственный эпизоотический фон на каждом предприятии также может повлиять на результат вакцинации.
Одним из важных критериев достоверности результатов ИФА является правильный отбор проб сыворотки крови. Кратность исследования соответствует плану серомониторинга предприятия.
В ситуациях, когда титры слишком различаются и коэффициент их вариации высокий, невозможно определить единую дату вакцинации для птицы всего корпуса. В этом случае наиболее эффективны иммунокомплексные вакцины, например, Бурсаплекс.
Диагностика методом ИФА с помощью тест-систем BioChek, при соблюдении вышеперечисленных правил и верной интерпретации результатов, позволяет весьма успешно и точно определить подобные отклонения для принятия решений при вхождении с вакцинацией против ИББ.
Таким образом, серологический мониторинг циркуляции вируса ИББ в стаде при исследовании в тест-системе ИФА компании BioChek – инструмент для снижения расходов и получения прибыли предприятием.
Литература:
1. Кэлнек, Б.У. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц: в 3 ч. / пер. с англ. М.: Аквариум Принт, 2011. Ч. 3. С.14, 25.
2. Вирус инфекционной бурсальной болезни: выявление новой генетической группы и реассортантов /Л.О. Щербакова, Е.В. Овчинникова, Т.Н. Зыбина, С.Н. Колосов, Н.Г. Зиняков, З.Б. Никонова, Д.Б. Андрейчук, И.А. Чвала // Ветеринария сегодня. 2022. Т. 11. №1. С. 7784.
3. Алиев А.С. Инфекционная бурсальная болезнь птиц / А.С. Алиев. СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2010. С. 7375,167168, 105106.
4. Иллюстрированный атлас болезней птиц. Издательский дом Медол, 2006. С. 4647.
5. Van Leerdam, B. Serological profile and calculation of halflife time with IBD ELISA in a commercial broiler breeder flock in the Netherlands / B. Van Leerdam, H.T. Arts // Zootecnica. 2011. No 78. P. 4449.
